講師は前回（細胞培養 特別講義 第15回）に引き続き、順天堂大学の赤松和土先生です。前回は、神経幹細胞の特徴やマウスからの単離培養法、ニューロスフェア法による培養法などをご紹介いただきました。

今回は、ES/iPS細胞から神経幹細胞を誘導する方法をご紹介いただきます。ヒトiPS細胞が樹立された当初、どのように神経幹細胞を誘導し、どのくらいの時間がかかったのでしょうか。また、当時の問題点はどのように改良されてきたのでしょうか。

大変興味深い内容となっておりますので、ぜひお楽しみください。

■ 講師紹介ページ：順天堂大学　赤松 和土 先生

■ 第15回 神経幹細胞を培養する 

“ ES/iPS細胞から神経幹細胞を誘導する ”

順天堂大学大学院 医学研究科
ゲノム・再生医療センター 特任教授
赤松 和土 先生

　ES細胞は体細胞の全ての種類の細胞に分化誘導可能な細胞であり、1981年にEvansらによって初めてマウスで樹立された。以降Capecchiらによりノックアウトマウスの作製に用いられる重要な技術となった。ヒトのES細胞は1998年にThomsonらによって初めて樹立され、その頃から再生医療用途としてのin vitroでの分化誘導が着目されるようになる。少し遡る1995年に、EC細胞で用いられていた分化誘導系を参考にマウスES細胞から胚様体を経由してレチノイン酸を添加することにより神経分化が誘導されることが報告されている（文献1）。

ES細胞からの神経分化誘導方法は様々な方法があるが、共通するのは初期の神経誘導を抑制することが知られるBMPシグナルを何らかの方法で阻害することである。脊椎動物の初期の発生過程において神経誘導活性のあるオーガナイザーから分泌される神経誘導因子が何かは長らく不明であったが、1980年代にNoggin, Chordin, FollistatinがいずれもBMPシグナルを阻害することによって神経分化を誘導することが明らかになった。いわゆるdefault modelと呼ばれるモデルが確立され、この考え方が低密度培養やNogginの添加などでBMPシグナルを阻害するとES細胞が効率よく神経分化誘導されるという手法の確立につながっている。

マウスではKawasakiらによるPA6細胞をフィーダーとしたドーパミンニューロンの誘導（文献2）、Tropepeらによる低密度培養を用いた方法（文献3）などが2000年代初めに報告された。前者の方法はSDIA(stromal cell derived inducing activity)法と呼ばれているが、PA6細胞から神経分化誘導を促進する因子が分泌されていると推測されている。後者の方法は単離したES細胞を低密度浮遊培養してBMPシグナルを阻害し、幼若な神経幹細胞(Primitive Neural Stem Cell; pNSC)に転換させニューロスフェアを形成させる方法である。pNSCは通常の神経幹細胞が成長因子として要求するFGF-2だけでは増殖しニューロスフェアを形成できず、ES細胞の未分化維持因子であるLIFを生存因子として添加した場合のみニューロスフェアを形成する点が特徴である。

　その後、ヒトiPS細胞が2007年に報告され、ヒトES細胞とほぼ同一の手法で神経分化が可能なことが明らかになってきた。ヒトES/iPS細胞において接着培養によって神経幹細胞/前駆細胞を維持する方法が報告され（文献4）、一方でヒトiPS細胞から胚様体を経てニューロスフェアを形成する方法で誘導した神経幹細胞は、脊髄損傷モデル動物の運動機能を回復させることが示された（文献5）。

当時の方法ではヒトES/iPS細胞から移植可能な神経幹細胞を誘導するまで3ヶ月程度を要していたが、iPS細胞を用いた再生医療前臨床研究および疾患研究が進展するにあたってより効率の良い神経分化誘導方法の開発が求められた。筆者らはマウスES細胞で行われていた低密度でBMPシグナルの影響を排除する方法をヒトiPS細胞に応用し、低酸素培養を併用することにより従来よりも短期間で神経幹細胞を誘導することに成功した（文献6）。

ヒトiPS細胞はクローンによって分化指向性が異なる上に、由来細胞によっても分化傾向が大きく異なっていたため、線維芽細胞由来のiPS細胞と血球由来のiPS細胞で分化傾向が異なることが問題になりつつあった。2010年に血球から安定してiPS細胞を樹立する技術が開発され、検体採取が簡便である血球由来のiPS細胞が主流となることは明らかであったが、従来の方法では血球由来のiPS細胞は胚様体を形成させた際に含まれる外胚葉系の細胞が少ないために、その後の神経誘導の効率が極めて低かった。筆者らの方法はBMPシグナル阻害によって未分化なiPS細胞を神経分化誘導するため、iPS細胞の由来細胞によるこのような分化誘導効率の差を無視できるまで小さくすることができた。

　現在でもヒトiPS細胞の神経分化誘導方法の改良は続けられており、効率よい神経分化誘導法にはNogginだけでなくLefty/Activin/TGFβ経路阻害剤であるSB431542を組み合わせるdual SMAD inhibitionといわれる方法が良く用いられている（文献7）。さらに高価なNogginを安価な化合物であるdorsomorphinに置き換えることによっても神経分化誘導が促進されることが明らかになっており、現在ではdorsomorphin/ SB431542の組み合わせが最も一般的である。このような神経分化誘導方法の改良が実際のiPS細胞を用いた再生医療前臨床および疾患モデルにどのように用いられているかを次回は紹介する。

【文献】

1. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E. & Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342–57 (1995).
2. Kawasaki, H. et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron 28, 31–40 (2000).
3. Tropepe, V. et al. Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron 30, 65–78 (2001).
4. Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J. & Brüstle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3225–30 (2009).
5. Nori, S. et al. Grafted human-induced pluripotent stem-cell-derived neurospheres promote motor functional recovery after spinal cord injury in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 16825–16830 (2011).
6. Matsumoto, T. et al. Functional Neurons Generated from T Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Neurological Disease Modeling. Stem cell reports 6, 422–35 (2016).
7. Chambers, S. M. et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275–280 (2009).

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